Métodos de ingeniería genética.

We are searching data for your request:

Forums and discussions:

Manuals and reference books:

Data from registers:

Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Transformación por electroporación

Durante la electroporación, la membrana celular se cambia mediante un breve impulso eléctrico para que las células puedan absorber el ADN del medio ambiente. Sin embargo, antes de la electroporación, las células deben ser competentes para la absorción de ADN. Atención: la fabricación electrocompetente E. coli-Las células son diferentes de producir CaCl₂-¡Células competentes!

La producción de células electrocompetentes.

40 $mL$ S.O.C.-Medium están con 2 $mL$ inoculado a un cultivo durante la noche y hasta un título de 3 x 10⁸a los 37 $° C$ agitado. El enfoque es entonces para 15 $min$ enfriado en agua helada y durante 15 $min$ en el rotor preenfriado de la centrífuga refrigerada a 6.000 rpm y 4 $° C$ centrifugado. El sobrenadante se elimina cuantitativamente y las células en 5 $mL$ bidista. Agua resuspendida. A continuación, se vuelve a desechar el vaso de precipitados de centrífuga. Agua rellenada y otra vez durante 15 $min$ en el rotor preenfriado de la centrífuga refrigerada a 6.000 rpm y 4 $° C$ centrifugado. El sobrenadante se elimina cuantitativamente, las células en 20 $mL$ Se resuspendió glicerol al 15% y se centrifugó de nuevo como antes y se eliminó el sobrenadante.

El pellet ahora está en 0.5-1 $mL$ 15% de glicerol resuspendido y en porciones de 100 µl en tubos Eppendorf a -80ºC. $° C$ congelado o utilizado directamente para electroporación.

La electroporación

Las células electrocompetentes se descongelan en hielo, se mezclan con el ADN plasmídico y se incuban en hielo durante un minuto antes de pipetear la mezcla en las cubetas de electroporación preenfriadas (también en hielo).

Para la electroporación, la cubeta debe secarse completamente antes de que se inserte en el aparato de pulso y se active el electropulso. Los datos del pulso dependen del espaciado de los electrodos y son para E. coli por ejemplo, 25 µF, 600 ohmios, 2,5 kV.

Inmediatamente después del pulso, 1 $mL$ Se añadió medio S.O.C. y la mezcla se transfirió a un tubo Eppendorf. Después de una fase de regeneración de aproximadamente 1 hora a 28-30 $° C$ las células transformadas se pueden plaquear en medios de selección.